Более 60 % гомеопатических лекарственных средств (ГЛС) изготавливаются из лекарственного растительного сырья (ЛРС), большая часть которого является неофицинальным [2]. Наиболее распространенной "субстанцией", использующейся для изготовления ГЛС, является гомеопатическая матричная настойка (ГМН). Специфика технологического процесса приготовления ГМН заключается в изготовлении их из соков свежих растений, заготовленных в период максимального накопления биологически активных веществ (БАВ) [4].

Однако, ни свежее растение, ни сок, полученный из него, не стандартизуются. Общие методы анализа ГМН в большинстве своем совпадают с методами анализа жидких экстрактов, к которым они близки по своим физико-химическим свойствам.

Ранее нами были обоснованы общие показатели, по которым целесообразно оценивать качество ГМН [3]. Следует отметить, что в Немецкой гомеопатической фармакопее для значительной части ГМН предусматривается тест на подлинность с проведением тонкослойной хроматографии (ТСХ). При анализе хроматограммы, как правило, не указываются действующие вещества, а дается лишь описание хроматограммы с указанием последовательности расположения зон. Иногда используется вещество - стандарт или вещество - маркер, которое не содержится в настойке и занимает центральное положение на хроматограмме. При этом расположение зон ГМН описывается по отношению к маркеру [6].

Целью наших исследований является изучение возможности идентификации ГМН по качественному составу основных групп БАВ, с помощью таких специфических методов анализа как ТСХ и спектрофотометрия в УФ - и ИК - областях спектра.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили ГМН Pulsatilla и Phytolacca, приготовленные из свежего сырья растений Прострел луговой (Pulsatilla pratensis, семейство Лютиковые) и Лаконос американский (Phytolacca americana, семейство Лаконосовые). Приготовление эссенций проводили в строгом соответствии с технологическим предписанием ( §1,§3) приготовления ГЛС [4].

Хроматографические исследования проводили на бумаге для хроматографирования марки "Filtrak-FN-1". В работе использовали следующие системы растворителей для хроматографирования :

Соотношения растворителей, указанные цифрами, брали по объему. Способ хроматографирования - восходящий. Хроматографирование в системах № 4 и № 5 проводили методом двумерной хроматографии, при этом около 0,1 мл ГМН Pulsatilla наносили на лист хроматографиче-ской бумаги размером 40x40 см и разгоняли пятно восходящим способом. В одном исследовании использовалась система № 4 в двух направлениях, а в другом случае система № 4 - первое направление, система № 5 - второе направление.

Все значения Rf являются средними величинами двух определений.

Готовые хроматограмы высушивали на воздухе, наблюдали в дневном, УФ - свете без проявления, и при обработке парами аммиака, 5 % спиртовым раствором алюминия хлорида с последующим выдерживанием в сушильном шкафу при температуре 100-105°С в течение 2-3 минут (№ 3). Полученные хроматографические пятна в системах №3, №4,№5,№7 элюировали 45 % этиловым спиртом и проводили качественные реакции на основные группы БАВ.

Хроматографические исследования в тонком слое сорбента (ТСХ) проводили с использованием пластинок "Silufol UV-254", восходящим способом в системах растворителей №1, №5, №10 - метанол - хлороформ (11:89) (Pulsatilla, Phytolacca), №6, №7, №8, №9 (Phytolacca), №11 -этилацетат - метанол - вода (10:2:1), №12 - бензол - этилацетат (75:25) (Pulsatilla).

Хроматограммы высушивали на воздухе, наблюдали в УФ свете без проявления и при обработке парами аммиака, 20% раствором кислоты серной с последующим выдерживанием в сушильном шкафу при температуре 110°С в течение 10 минут (№1,№11), 1 % спиртовым раствором калия гидроксида с последующим высушиванием на воздухе (№8,№9), 5 % спиртовым раствором алюминия хлорида по методике, указанной выше (№11).

Спектры поглощения ГМН в УФ области регистрировали на спектрометре "Perkin - Elmer Lambda 14 (1,3)" в кювете с толщиной слоя 1 см в области длин волн 220-400 нм. В качестве растворов сравнения использовали 45 % и 60 % этиловый спирт. При этом ГМН Pulsatilla разбавляли 60 % этиловым спиртом в 250 раз, ГМН Phytolacca разбавляли 45% этиловым спиртом в 50 раз.

ИК-спектр ГМН в таблетке калия бромида в области 4000-400 см"1 регистрировали на приборе марки "Perkin-Elmer-325". Методика приготовления образца для записи ИК- спектра была следующей: 5мл ГМН помещали в выпарительную чашку, высушивали в сушильном шкафу при температуре 100-105°С в течение 45 мин., затем выдерживали в эксикаторе 1 час. Далее поступали как описано в ГФ XI издания [5].

Результаты и их обсуждение

Необходимым условием оценки качества ГМН является идентификация основных групп БАВ. ЛРС, которое мы использовали в своих исследованиях, не является официальным. По литературным данным виды растений рода Pulsatilla и Phytolacca содержат тритерпеновые сапонины [1,10]. Помимо сапонинов в надземной части пяти исследованных видов рода Pulsatilla обнаружено четыре флавоноида, два из которых идентифицированы как кверцетин и кемпферол [7].Предварительно проведенные качественные реакции на группы БАВ показали на присутствие в ГМН Pulsatilla флавоноидов, относящихся к подгруппе изофлавоноиды (реакция с железа (III) хлоридом и гексацианоферратом калия) [3]. Помимо тритерпеновых сапонинов в ЛРС Лаконоса американского присутствует алкалоид фитоляккцин, эфирные масла и сахара (глюкоза, фруктоза) [1,10]. Немецкая гомеопатическая фармакопея для идентификации тритерпеновых сапонинов Phytolacca americana предлагает реакцию пенообразования и реакцию гемолиза эритроцитов в геле кровяной суспензии. Сахара идентифицируются по реакции с 1 % раствором резорцина в кислоте хлористоводородной [9]. Помимо этого предлагается метод ТСХ в системе №6, но без предварительного выделения сапонинов, обнаружить их в ГМН не удаётся.

Для идентификации тритерпеновых сапонинов в ГМН Phytolacca, наряду с вышеперечисленными реакциями,использовали реакцию с уксусным ангидридом и кислотой серной концентрированной [3]. Для выделения тритерпеновых сапонинов методом ТСХ предлагаются системы №1, №7, №8. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты хроматографического исследования гомеопатической матричной настойки Phytolacca

Хроматографическая бумага, смоченная ГМН Phytolacca, имеет в УФ-свете голубую флюоресценцию. Помимо этого изменение цвета флюоресценции после обработки 1 % спиртовым раствором калия гидроксида говорит о возможном присутствии в ГМН соединений, относщихся к группе кумаринов.

Для идентификации флавоноидов и тритерпеновых сапонинов ГМН Pulsatilla предлагаются системы №1, №5, №12 (система предложена Э. Шталем для выделения изофлавоноидов) [8], двумерная хроматография в системе №4. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты хроматографического исследования гомеопатической матричной настойки Pulsatilla

Таким образом, проведенный нами хроматографический анализ подтверждает наличие в ГМН Phytolacca тритерпеновых сапонинов и предварительно соединений кумаринового ряда, а в ГМН Pulsatilla- тритерпеновых сапонинов и изофлавоноидов.

Для подтверждения данного вывода мы использовали спектральные методы анализа. УФ -спектр поглощения ГМН Phytolacca имеет плечо в области 254 - 266нм, что указывает на присутствие тритерпеновых сапонинов. УФ - спектр поглощения ГМН Pulsatilla характеризуется максимумом при длине волны 260,5 нм и плечом при 310-320 нм, что указывает на наличие изофлавоноидов и тритерпеновых сапонинов (рис. 1). Изучение ИК - спектра образца ГМН Pulsatilla показало отсутствие характеристического максимума поглощения, а ИК - спектр ГМН Phytolacca имеет максимумы поглощения в области 1370см' , 1450см"1, 1685см"1, 1725см"1, 1990см"1.

Учитывая вышеизложенное, можно сказать, что проведенные исследования могут быть положены в основу проведения испытаний на идентичность ГМН, и являются теоретической базой для разработки показателей качества активного "ингредиента" ГЛС.

Вывод

Для идентификации БАВ ГМН Pulsatilla и Phytolacca целесообразно использовать метод ТСХ и спектральные методы анализа. Оптимальными системами растворителей для идентификации основных групп БАВ являются: хлороформ - метанол - вода (65:30:10), 15 % кислота уксусная, бензол - этилацетат (75:25) - ГМН Pulsatilla; хлороформ - метанол - вода (65:30:10), хлороформ - метанол (3:1) - ГМН Phytolacca. УФ - спектр поглощения ГМН Pulsatilla характеризуется максимумом при длине волны 260,5 и плечом при 310 - 320 нм; УФ - спектр поглощения ГМН "Phytolacca" имеет плечо при длине волны 254 - 266 нм. ИК - спектр ГМН Phytolacca характеризуется максимумами поглощения в области 1370см"1, 1450см"1, 1685см"!, 1725см"1, 1990см"1.